O nás Kontakty Sekvenování Formulář a ceník Časté dotazy Apendix
Kmeny E. coli vhodné pro isolaci a sekvenování templátové DNA
Volba hostitelského kmene je pro sekvenování templátu prvořadě důležitá. Některé kmeny E. coli modifikují báze methylací, která znemožňuje elongační fázi sekvenování, jiné kmeny produkují velké množství endonukleas, které degradují templátovou DNA. Pokud se nelze vyhnout použití nedoporučovaného kmene, pak je nutné zařadit fenolizaci, která odstraní přítomné současně isolované nukleasy.
Následující tabulka shrnuje nejčastěji používané kmeny E. coli rozdělené dle zkušeností řady sekvenačních laboratoří na doporučené a nedoporučované kmeny. Doporučené kmeny by obecně měly být endA1, rec a dam mutanti.
Kmen
E. coli		Genotypický popis
Doporučené
DH5αφ80dlacZΔM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-,mk+), supE44, relA1, deoR, Δ(lacZYA-argF) U169, phoA
DH1recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-,mk+), supE44, relA1
C600thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, supE44
HB101thi-1, hsdS20(rB-,mB-), supE44, recA13, ara-14, leuB6, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(strr), xyl-5, mtl-1
XL1 BluerecA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-,mk+), supE44, relA1, lac, [F´, proAB, laclqZΔM15::Tn10(tetr)]
JM109endA1, recA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-,mk+), relA1, supE44, Δ(lac-proAB),[F´ traD36 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15]
JM101F´ traD36 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/ Δ(lac-proAB) glnV thi
Nedoporučované
NM522supE, thi, Δ(lac-proAB], hsd5(rk-,mk+), [F, proAB, laclqZΔM15]
TG1F´ traD36 lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+/supE Δ(hsdM-mcrB)5 (rk-mk+McrB-) thi Δ(lac-proAB)
KC8hsdR, leuB600, trpC9830, pyr::Tn5, hisB463, lacΔX74, strA, galU, galK.
BL21 a jeho
deriváty		F-, ompT, hsdSB(rB-,mB-), dcm, gal,
Primery vhodné pro sekvenování
Pro navrhování primerů existuje řada metod, popsaných v literatuře. Nám se osvědčilo dodržovat následující pravidla:
  1. Primery musí být navrženy ze známé a kvalitní sekvence a měly by být 100% homologní k templátu. Většinou fungují i primery mající na 5´ konci jednu až dvě záměny nebo převis (např. restrikční místo). Naopak primery se záměnou na 3´ konci jsou zcela nevhodné.
  2. Teplota tání Tm primeru by měla být v rozmezí 55-60°C. Máme zkušenosti, že primery jejichž Tm je nižší než 55°C dávají slabý signál a sekvenování s primery o Tm vyšší než 65°C má vysoké pozadí.
     
    Existuje řada metod pro výpočet teploty tání primeru Tm (např. v závislosti na koncentraci iontů v roztoku, atd.)(SantaLucia et al., 1998; Owczarzy et al., 2004). Pro jednoduchý výpočet teploty tání se často používá následující výpočet:
     
          Tm = 2x (součet A+T) + 4x (součet G+C)
     
  3. Primery pro sekvenační reakce by měly mít délku mezi 18 a 25 nukleotidy.
  4. Obsah GC by měl být 50 - 55%.
  5. Je s výhodou, pokud na 3´ konci primeru je alespoň jeden G nebo C.
  6. Pokud to jde, snažíme se vyhnout homopolymerním oblastem (např. CCCC, atd.), opakujícím se sekvencím (např. GATCGATC) a sekundárním strukturám (např. GATCNNNGATC).
Které standardní primery nabízíme
Omlouváme se, ale na seznamu se pracuje.
Počet kopií plazmidu
Podle počtu kopií plazmidu v buňce dělíme plazmidy na vysokokopiové (300 a více kopií), středně kopiové a nízkokopiové (20 a méně). Tento počet závisí např. na původu počátku replikace a dále na velikosti plazmidu a vloženého insertu. Některé plazmidy jako je pUC a jeho deriváty obsahují mutace, které umožňují dosáhnout vysokého počtu kopií v buňce. Naproti tomu plazmidy odvozené od pBR322 a většina kosmidů se vyskytují v menším počtu kopií. Velmi velké plazmidy jsou většinou v nízkém počtu kopií.
Dále platí, že vložený insert významně ovlivňuje počet kopií plazmidů a kosmidů v buňce. Například vysokokopiový pUC plazmid se může díky insertu chovat jako středně kopiový, což má za následek nižší výtěžek DNA při isolaci. U nízkokopiových plazmidů je pro isolaci DNA nutno použít větší množství kultury.
Doporučená literatura
Taylor et al.: Nucleic Acids Research, 1993;21: 1677 - 1678
Birnboim H.C. and Doly J.: Nucleic Acids Research, 1979, Vol. 7, No. 6: 1513-1523
SantaLucia, J., Jr Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95 (4): p. 1460-5.
Owczarzy, R et al. Biochemistry, 2004. 43(12): p. 3537-54.