Pro úspěšné sekvenování vašeho vzorku je velmi žádoucí poskytnout
všechny námi požadované údaje uvedené u jednotlivých kapitol.
Po kliknutí na jednotlivé pojmy se objeví upřesnění našich požadavků.
O nás Kontakty Sekvenování Formulář a ceník Časté dotazy Apendix
     
 1. Bakteriální kolonie Mini-izolace templátové DNA
(plazmidy, kosmidy)
 
     
   Kontrola templátu
(elektroforéza v agarosovém gelu)
 
     
 2. Templátová DNA Sekvenační reakce 
     
   Přečištění sekvenační reakce 
     
 3. Hotové sekvenační reakce Analýza sekvenační reakce 
     
   Vyhodnocení sekvenačních dat
a rozesílání výsledků e-mailem
 
     
Dodací lhůta a doručení výsledků sekvenační analýzy
1. Bakteriální kolonie s templátovou DNA
Templátová DNA pro sekvenační reakci bude připravena z kultur E. coli kultivovaných v naší laboratoři. Součástí standardní isolace je stanovení koncentrace, velikosti a kvality templátové DNA pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Po dohodě jsou však možné i další úkony či kontroly, jako např. proměření vzorku na spektrofotometru v UV oblasti, restrikční analýza, kontrola insertu pomocí jeho reamplifikace, atd.
Dáváme přednost kultuře rozočkované na jednotlivé kolonie nebo klonu v tekutém mediu. Před vlastní isolací je nutné, abychom znali následující údaje:
  • jméno vektoru a jeho rezistenci k antibiotiku
  • velikost celého konstruktu (vektor + insert)
  • pokud se jedná o nízkokopiový plasmid (apendix), prosíme o zvláštní upozornění
  • jméno hostitelského kmene E. coli
Pro úspěšnou isolaci a sekvenaci templátové DNA má volba správného hostitelského kmene velký význam. Více informací najdete zde.
2. Templátová DNA
Vlastnosti isolované templátové DNA podstatným způsobem ovlivňují výsledky sekvenování. Obecně platí, čím čistší DNA tím lepší výsledek sekvenování. DNA by měla být rozpuštěna ve vodě nebo v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Pro získání dobrých výsledků by DNA neměla obsahovat zbytky proteinů, solí, RNA, fenolu či další organickou kontaminaci. Každopádně doporučujeme kontrolovat kvalitu a množství dodávané templátové DNA na agarosovém gelu. Pouhé měření koncentrace DNA ve spektrofotometru není vždy dostačující.
Nejčastější rozdělení templátové DNA je na plazmidovou DNA, PCR produkt, kosmidovou DNA, BAC DNA a jinou nízkokopiovou DNA:
a) Plazmidová DNA
Templátová DNA připravená klasickou miniprepovou metodou (Birnboim a Doly, 1979) ve většině případů neposkytuje vyhovující sekvenační výsledky. Proto důrazně doporučujeme použití minikolonek pro čištění plazmidové DNA , které fungují na bázi afinitní chromatografie nebo na bázi iontoměniče. Použití takovýchto kolonek zaručuje ve většině případů přípravu DNA o požadované čistotě, koncentraci a množství.
b) PCR produkt
PCR produkt lze sekvenovat, ale je třeba ho předem zbavit neinkorporovaných dNTP a primerů. Přítomnost primerů by způsobila nečitelnou směs sekvencí a dNTP by změnily poměr koncentrace dNTP/ddNTP. Pro purifikaci doporučujeme použít komerční PCR spin column kity.
Pokud PCR produkt tvoří pouze jeden proužek na agarosovém gelu, lze ho pouze přečistit a následně použít pro sekvenační reakci. Pokud na agarosovém gelu detekujeme více než jeden PCR produkt, máme několik možností. Jednak můžeme ten o požadované velikosti vyříznout z gelu, přečistit a provést sekvenaci. Pokud známe sekvenci PCR produktu je další možností použítí specifického vnitřního primeru buď pro reamplifikaci nebo přímo pro sekvenaci (nested primer).
c) BAC, kosmidy, fosmidy a jiné nízkokopiové konstrukty
Sekvenování takovýchto konstruktů je mimořádně náročné a vyžaduje extrémní podmínky sekvenační reakce. Naprosto nezbytná je nejvyšší kvalita dodané DNA. Doporučujeme použití speciálních kitů pro isolaci těchto nízkokopiových konstruktů, které pracují většinou na bázi křemičitých iontoměničů.
Doporučené minimální množství a koncentrace dodané templátové DNA
Firemní materiály uvádějí minimální množství templátové DNA pro úspěšné sekvenování (http://www.appliedbiosystems.com -BigDye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Manual, kat č.: 4337035).
V naší laboratoři se nám osvědčilo pro plazmidy a lineární fragmenty včetně PCR produktů dodržovat následující jednoduché pravidlo: Na 100 bp templátové DNA je třeba dodat 10 ng vzorku pro jednu sekvenační reakci. Např. do jedné sekvenační reakce plazmidu o velikosti 6,5 kb dáme cca 650 ng templátové DNA. Toto pravidlo nelze uplatnit při sekvenování BAC, kosmidů a fosmidů. Zde požadujeme koncentraci templátové DNA minimálně 0,2 ?g/?l a nejméně 10 ?l pro jednu reakci.
Doporučujeme dodat větší než minimální množství templátové DNA pro případné opakování sekvenace.
Primery
Středisko sekvenování nabízí celou řadu standardních primerů, které jsou vhodné pro sekvenování insertů naklonovaných do často používaných vektorů. Jejich seznam a sekvence lze najít zde. Prosíme o dodržení našeho názvosloví pro eliminaci nedorozumění.
Pokud máte svůj vlastní primer pro sekvenační reakci, dodejte ho, prosíme, rozpuštěný ve vodě v koncentraci 10 pmol/?l (10 ?M roztok) v minimálním množství o 5 ?l větším než je požadovaný počet reakcí s tímto primerem.
3. Hotová sekvenační reakce
Příprava hotových sekvenačních reakcí vyžaduje již značnou zkušenost nejenom při přípravě templátu (viz bod 1. a 2.), ale také při provádění vlastních sekvenačních reakcí a jejich finálním zpracování. Úspěšné provedení sekvenační reakce ovlivňuje řada faktorů jako např.:
  • poměr templát / sekvenační mix
  • annealingová teplota použitého sekvenačního primeru
  • doba jednotlivých kroků sekvenační reakce (denaturace, annealing, elongace)
  • počet cyklů sekvenační reakce
  • způsob čištění hotové sekvenační reakce a jiné
Optimalizace všech těchto parametrů je poměrně náročná a často je třeba provést řadu seriových pokusů. Pokud dodáváte hotovou sekvenační reakci, je nezbytné splnit následující požadavky:
Sekvenační reakce musí být
  • provedena kitem BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit firmy Applied Biosystems
  • přečištěna (pomocí např. precipitace, magnetických kuliček, affinitní chromatografie, gelové filtrace, atd.)
  • dodána buď ve formě vysušeného peletu nebo rozpuštěna v 15 - 20 ?l HiDi formamidu (Applied Biosystems* kat č.: 4311320)
* - výhradní dodavatel chemikálií firmy Applied Biosystems pro Českou republiku je firma Applera Česká republika, s.r.o. Použití reagencií pro fluorescenční sekvenování od jiného výrobce se nedoporučuje z důvodu odlišnosti použitých fluorochromů.
Dodací lhůta a doručení výsledků sekvenační analýzy
Vždy se snažíme zpracovat vaše vzorky v nejkratší možné lhůtě.
Výsledky sekvenační analýzy standardně posíláme e-mailem ve dvou formátech .ab1 a .txt. Pro prohlížení a editaci doporučujeme použít data ve formátu .ab1.Tento formát lze otevřít v různých programech pro analýzu a zpracování sekvenačních dat jako je Chromas, ChromasPro, DNA Star - Lasergene, SeqScape, CLC Workbanch, Sequence Scanner (volně stažitelný). Všechna data jsou u nás uložena na CD, což nám umožňuje i po delší době provést reanalýzu (posun začátku čtení, výběr jiných analytických algoritmů, atd.). Lze je také přímo stáhnout u nás na váš flash disk.